在MS基本培养基中附加30mg·L-1蔗糖、6.5mg·L-1琼脂粉、0.3mg·L-16-苄基腺嘌呤和0.1mg·L-1萘乙酸（naphthalene-aceticacid），pH5.6的培养基。将平邑甜茶的组培苗在该继代培养基上培养生长35天，即可切取叶盘进行转基因的步骤。根癌农杆菌LBA4404携带植物表达载体p121-Cre-Gus的质粒（图1）,在28℃下LB液体（100mg·L-1卡那霉素）培养基培养16小时,备用。在超净工作台上取组培苗伸展叶片，用剪刀剪成约0.1cm2的叶盘，放在上述培养物中5分钟，然后接种在再生培养基上黑暗条件下1天；然后转接在含300mg·L-1头孢霉素的分化培养基上，温度（25±1）℃下暗培养14天，然后置于光周期16小时光照/8小时黑暗、光照强度为30μmol·m-2·s-1的条件下再培养30天，可获得转化芽；GUS染色，从转化芽和阴性对照的幼叶上剪取1~2cm的叶块，放入装有GUS染色液的离心管中，37℃培养箱中进行GUS组织染色，16h后取出叶片，先以20％乙醇清洗样品20min，再用50％乙醇清洗30min，最后用70％的乙醇脱色，脱至白色为止。提取转基因平邑甜茶DNA，PCR扩增模板：GUS检测阳性植株DNA、阳性质粒DNA、阴性对照。GUS基因：上游引物GTCAGTCCCTTATGTTACG下游引物TGATTCATTGTTTGCCTCNPTII基因：上游引物GGGATTGAACAAGATGGATTGC下游引物CATGTGTCACGACGAGATCCTCPCR反应体系：2.0μLPCRbuffer，2.5μLMgCl2，1μLdNTPS，引物各1μL，聚合酶2单位，水补足20μL。反应程序：94℃5min,(94℃30s,55℃30s,72℃60s)35个循环，72℃10min，15℃保持，扩增产物进行凝胶电泳，并且在紫外灯下成像。

研发单位：北京市农林科学院林果所

联系人：金万梅

电话：62859105